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Abstract
第23回 日本食品微生物学会学術総会(2002.9.24;東京)
LAMP法を用いた腸管出血性大腸菌の検出
根本二郎、百田隆祥、砂田亜津子、吉野学、安中敏光、宮島浩志、小島禎、池戸正成
(栄研化学(株) 生物化学研究所)
【目的】
Verotoxin(VT)を産生する腸管出血性大腸菌(enterohemorrhagic Escherichia coli :EHEC)は、出血性腸炎や溶血性尿毒症症候群の原因菌として注目されており、迅速な検出及び同定法の確立が急務とされている。そこで我々は迅速遺伝子増幅法である、LAMP(Loop-Medidated Isothermal Amplification)法を利用して、VT遺伝子を標的としたEHEC検出系の確立を開発したので報告する。

【方法】
VT1およびVT2遺伝子を特異的に増幅するLAMP用Primerセットをそれぞれに設計した。
VT2は変異が多いことから出来るだけ多くの変異に対応できるようPrimer配列に工夫を施した。VT1とVT2を同時に測定する系は、VT1,VT2用のPrimerを混合したmultiple-LAMPセットを設計した。

各primerセットの感度はVT1産生株ATCC43890、VT2産生株ATCC43889を用いて試験し、特異性試験には、当社研究所の保存株の中からVT産生能が確認されている大腸菌71株、VT非産生大腸菌78株、大腸菌以外のVT非産生菌37株を使用した。いずれの供試菌株とも、熱処理により核酸を抽出し、感度試験にはその10倍連続希釈系列を、特異性試験には1.5x105cfu/testになるよう調整した希釈液を用いた。なお、対照としてPCR法を併用した。

増幅条件は65℃一定温度で、反応系のインターカレーターの蛍光強度を連続蛍光光度計[ABI PRISM 7700]を用いて120分まで測定し、経時的に増幅反応を解析した。

【結果および考察】
VT1検出用セットおよびVT2検出用セットを用いた結果、VT1産生VT2産生大腸菌23株、VT1産生VT2非産生大腸菌25株, VT1非産生VT2産生大腸菌23株に鑑別でき、VT非産生大腸菌78株、大腸菌以外のVT非産生菌37株では増幅が認められなかった。この結果は、VT1, VT2を個別判定したPCRの結果と完全に一致した。また、各primerセットの感度は60cfu/test以上であった。更に、反応時間は各primer検出用セットとも、供試したVT産生株はすべて40分以内で増幅し、VT非産生株では120分反応後も増幅しなかった。

以上の事から、本検出系はVT産生株を簡便かつ高感度に検出できることから、迅速判定が要求される下痢原性大腸菌の判定、食品に含まれるEHECのスクリーニングに有用であると考えられた。

第23回 日本食品微生物学会学術総会(2002.9.24;東京)

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