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Abstract
(社)日本食品衛生学会総会(2003.5.14-15)
Loop-mediated isothermal Amplification(LAMP)法による食品中のサルモネラ検索の評価
埼玉県衛生研究所 大塚佳代子 藤原由紀子 柳川敬子
栄研化学株式会社 吉野 学  小島 禎  池戸正成
【目的】 
食品に対し、その安全、安心が求められ、消費者、製造者及び行政機関など各方面で様々な努力がなされてきた。食品を汚染する有害微生物の検査は、健康危害の発生防止並びに被害の拡大防止に重要である。今回、6種類のプライマーと鎖置換活性をもつDNAポリメラーゼを用いたDNA増幅検査法について、食品中のサルモネラを対象に検討し、日常及び非常時のモニタリング検査に有用であるかを評価した。

【方法】
1 増幅反応及び蛍光強度の検出
反応液はinvA遺伝子領域内に設定したプライマー、Bst DNAポリメラーゼ、MgSO4、Tris-HCl、(NH4)2SO4、TritonX-100、KCl、dNTPs、Betaine及びEtBrを至適濃度に調製し、1検体当たり20μlを使用した。
反応条件は一定温度(65℃)で、ABI PRISM 7700(Applied Biosystems)を用いて、反応系のインターカレーターの蛍光強度を60分間経時的に測定し、増幅反応を解析してサルモネラの有無を判定した。

2 特異性試験
供試菌は食中毒関連材料及び市販食品由来のサルモネラ29血清型、合計30株及び大腸菌等79株とした。LAMP鋳型は、Trypticase Soy Brothで一夜培養した菌液をTE bufferで段階希釈した後、95℃、5分加熱し、その5μlを使用した。

3 食品の検出感度
食販の牛生レバー、ブロッコリーの芽及び鶏卵各25gにSalmonella Enteritidis及びS. Worthingtonを接種し、Buffered Pepton Water(以下BPW)225mlを加え、35℃、18時間培養した。NaOHを添加した培養液は加熱処理し、LAMP鋳型とした。

4 培養法による菌の検出
LAMP法に使用したBPW培養液は、常法に従い、BPW−TT(RV)−XLD培養に供し、サルモネラの分離を行った。

5 市販鶏肉の汚染調査
市販鶏肉50検体について、両法によるサルモネラの検出率を比較した。

【結果と考察】 
29血清型、30菌株のサルモネラはLAMP法陽性、大腸菌等その他の細菌はLAMP法陰性となり、特異性があった。
食品からサルモネラの検出限界は、食品25g当たり数十個の菌量で蛍光強度の増加が確認され、LAMP法と平板分離培養法の結果が一致した。
鶏肉50検体のサルモネラ検出状況は、培養法陽性18検体、LAMP法陽性16検体であった。培養法のみ陽性となった検体は、サルモネラの汚染菌量がいずれも3個未満/100g(MPN)と少なかった。
検討したLAMP法は、特異性に優れ、培養法と同等の検出感度であり、加えて、培養法に比較し、検査日数が3日短縮できることから、食品のサルモネラ検査法として、適用できるものと考えられる。

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