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Abstract
第24回日本食品微生物学会学術総会(2003.10.2-3;岡山)
LAMP法による大腸菌の高感度迅速検出法
宮島浩志、小島禎、池戸正成
(栄研化学株式会社)
川崎晋、一色賢司
(独立行政法人 食品総合研究所)
【目的】
近年、食品の安全性を迅速に検査することが要求されている。そこで食品の糞便汚染の指標としての大腸菌を高感度かつ迅速に検出するために、LAMP 法(Loop-Mediated Isothermal Amplification)を利用した遺伝子増幅法を構築した。大腸菌特異の遺伝子領域として、構造遺伝子murZ を標的とした。
今回は、本方法の特異性及び検出感度について報告する。

【方法】
ゲノムデータベースよりmurZ 遺伝子配列の大腸菌に特異的な領域に対するLAMPプライマーを設計した。
この設計したプライマーの大腸菌に対する特異性を検討するために大腸菌30株、非大腸菌64株を使用した。この試験においては、反応あたり6000cfuとなるようにTEバッファーにより希釈調製した菌懸濁液を用いた。検出感度は、大腸菌ATCC25922を使用し、反応あたり 6, 60, 600, 6000cfuの菌懸濁液を用いて試験した。
いずれの試験共に、熱処理により核酸を抽出したものを鋳型としてLAMP反応に用いた。また反応条件は、65℃・120分の等温で行い、反応液中のインターカレーターによる蛍光強度の変化を経時的に測定し、増幅反応の有無を検討した。

【結果と考察】
実験に用いた30株全ての大腸菌と、遺伝学的に大腸菌と近似なシゲラ属菌15株に対して特異的な増幅反応を示した。増幅は、いずれも30分以内に認められた。非大腸菌49株においては、反応時間内に増幅は検出されなかった。また、大腸菌ATCC25922を用いた検出感度試験では、反応あたり大腸菌60cfu(熱変性処理)まで増幅可能であり、反応開始後約30分以内の増幅が検出された。
また、遺伝子増幅の際に生成するピロリン酸マグネシウムによる濁度の上昇で目視検出も可能であり、電気泳動よりも簡便な検出を行うことができた。
以上の結果より、今回設計したプライマーを使用したLAMP反応による大腸菌の検出は、特異性及び検出感度ともに高く簡便で、一時間以内での試験が可能なことから、有用な検出方法であると考えられた。

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