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Abstract
第51回日本臨床検査医学会総会・第44回日本臨床検査化学会年会 連合大会(2004.9.3-5;東京)
LAMP法原理と食中毒原因菌検出試薬、SARS検出試薬などへの応用、臨床への貢献
納富 継宣
(栄研化学株式会社)
LAMP(Loop−Madiated Isothermal Amplification)法は、1種の酵素のみを使用して、一定温度で高効率に遭伝子を増幅させる方法で、増幅領域の一方の鎖に相補的な配列を3'末端に持ち、5'末端にその鎖の内側の領域と同一配列を持つ1対のInner primerと1対のOuter primerを利用する。鎖置換型DNA polymeraseを用いて、分子内自己結合してループを形成した3'末端からの自己伸長と、ループ部分にアニールしたInner primerからの伸長反応が連続的に繰り返され、相補的な配列を交互に繰り返した構造の増幅産物を多量に合成することができる。

LMAP法の特徴は以下のとおりである。1)6領域を認識するために特異性が極めて高く、増幅時に生成するピロリン酸マグネシウムを指標に検出が可能。2)増幅効率が高く、短時間に増幅が可能。3)増幅産物は特徴的な構造を有する。4)等温かつ1種類の酵素で反応し、機器を含め極めて簡易である。5)逆転写酵素を追加するだけで、RNAからの増幅も簡単に高効率にできる。

これらの特徴を活かして食品微生物検査への応用を図った。試薬は、食品衛生検査指針に則った増菌培養液を検体とし、65℃,1時間で標的微生物の遺伝子を検出できる。

サルモネラ属菌検出試薬は、タイプV分泌系ニードル構造タンパクをコードするinvAを標的遭伝子として、60cfu/testのサルモネラ属菌のみを検出し、タイプV分泌装置をもつ感染型食中毒細菌のShigella属菌、Yersinia enterocoliticaは検出しないという高い特異性を有している。また、腸管出血性大腸菌検出、ベロ毒素タイピングの両試薬は、Vero毒素VT1型、VT2型を標的遺伝子とし、60cfu/testの腸管出血性大腸菌のみを検出し、大腸菌以外の菌は検出しない。また、タイピング試薬は菌希釈液よりVero毒素型をタイプできる。

一方、医療分野への応用としては、防疫体制の一環としてSARSコロナウイルス検査法を開発した。SARSコロナウイルスの全塩基配列情報(Gene Bank No.NC_004718)より、Replicase1B領域内にLAMP法用のプライマーを設計し、10コピー/testのSARSコロナウイルスを45分以内で検出でき、反応液に蛍光キレート剤カルセインを加えることで蛍光目視検出も可能としている。

以上のとおり迅速性、簡易性、高い特異性を持つLAMP法は、*培養検査期間と食品流通速度の逆転現象を補う「農場から食卓まで」の安全衛生管理、*新興、再興感染症の早期参断による防疫,感染拡大阻止、など応用範囲は広く、トータルコスト削減も含めて遺伝子検査の普及に有効な手法と考えられ、今後の臨床検査分野において更なる貫献を目指している
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