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Abstract
第11回リケッチア研究会(2004.10.23-24;倉敷)
LAMP法を用いたCoxiella burnetii の鶏卵からの検出法の検討
百田隆祥,小島禎,池戸正成
(栄研化学株式会社)
小川基彦,佐藤梢,アグス・スティヨノ,安藤秀二,荒川香南子,柳陳堅,岸本寿男
(国立感染症研究所 ウイルス第一部)
【目的】Coxiella burnetii は、野生動物や家畜、愛玩動物からヒトへ感染し、Q熱発症の原因となり、さらにいくつかの疾病への関与も疑われている。近年、食品から感染するリスクのある病原体として、C.burnetii が指摘され、鶏卵や卵関連食品もその対象とされているがその実態は明らかにされていない。そこで我々は迅速遺伝子増幅法であるLAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法を用いて、C.burnetii を鶏卵から迅速に検出する方法について検討を行った。

【方法】C.burnetii 測定LAMPプライマーは、C. burnetii の27-kDa outer membrane proteinをコードした遺伝子(com1 )を標的として設計した(第10回リケッチア研究会)。鶏卵からC.burnetii 遺伝子を抽出する方法を検討するために、C. burnetii U相菌の死菌を鶏卵にスパイクし、検体とした。C.burnetii 遺伝子抽出のために、@全卵からの卵黄の採取法、A卵黄からのC.burnetii 菌体の分離方法、BQIAamp DNA Mini KitによるC.burnetii 遺伝子DNA抽出法、これら3つの要因について検討した。

【結果と考察】C.burnetii 遺伝子DNA抽出段階での鶏卵由来蛋白の混入を抑えるために、全卵から分けた卵黄を、メッシュ(目開き425μm)に通し、残った卵白、カラザ等の成分を除去し、卵黄液を採取した。得られた卵黄からC.burnetii 菌体を遠心分離する過程で、沈渣(C.burnetii 菌体)への卵黄成分の混入を少なくするために卵黄液 10mLに5% NaCl, 0.1% Tween-20/PB pH 7.2を30mL添加した後、13,000rpm・45min・4℃で遠心し、上清除去後、2mLのTEを添加・混合後、12,000rpm・45min・4℃の条件で遠心し、沈渣を採取した。得られたC.burnetii 菌体をQIAamp DNA Mini Kit(Qiagen社製)で、沈渣量に合わせて最適化した条件の下、DNA抽出した。今回検討した処理法で得た検体をLAMP法で測定した結果、1,000cells/卵黄10mL(卵1個の卵黄量を17mlとすると1,700cells/卵黄1個)が検出可能であり、添加した菌体と同等の回収結果が得られた。以上の結果から本処理法とLAMP法を組み合わせることによって、迅速・簡易に鶏卵のC.burnetii 汚染の有無を鑑別できると考えられた。

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