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Abstract
第7回日本遺伝子診療学会大会 (2000.6.15; 浜松)
鎖置換型合成とステムループ形成を利用した新規遺伝子増幅法の開発
納富継宣、増渕晴美、米川俊広、渡辺恵子、長谷 哲
(栄研化学株式会社)
【目的】
これまでにPCR法をはじめとして、種々の遺伝子増幅法が開発されている。しかし、PCR法、LCR法は反応に、温度サイクルを必要とする。また、NASBA法、SDA法等の等温増幅法は複数の酵素や特殊な試薬を必要とするなど、改良すべき点が多い。そこで我々は、1種類のDNA合成酵素を用いて、一定温度で増幅する新しい遺伝子増幅法の開発を行ったので報告する。

【方法】
1) 試薬:DNA合成酵素として鎖置換型DNA合成を行なうBst Polymeraseを使用した。プライマーは、伸長後DNA鎖がループ構造をとりうる内部プライマー2種、及び外部プライマー2種を使用した。なお、鋳型がRNAの場合は、耐熱性の逆転写酵素(AMV RTase)を添加し、逆転写および増幅反応を一定温度でおこなった。2)反応:鋳型核酸にポリメラーゼ及びプライマー類を含む反応液を添加し、60-65℃で1時間保温した。3)解析:反応後アガロースゲル電気泳動、あるいはABI7700を用いて測定した。また増幅産物の解析は、サザンブロットハイブリダイゼーション及び塩基配列の決定により行った。

【結果】
1)DNAの検出:反応後電気泳動し、SYBR GreenT染色により、6分子のHBV DNAを検出できた。2)RNAの検出:106細胞中に存在する1個の前立腺特異抗原発現細胞を検出できた。3)増幅産物:標的DNAが互いに逆向きに、同一鎖上で繰り返し存在する特徴的な構造を有することがわかった。

【結論】
本法は、1)一定温度で増幅反応が進行する。2)増幅反応は鋳型上の6つの領域を認識しておこるため、特異性が高い。3)増幅効率が非常に高いため、極微量の核酸を短時間に検出することが出来る。4)鋳型がRNAの場合においても、逆転写および増幅反応を一定温度で可能である。5)増幅産物は特徴的な構造を有する。6)上記の特徴を生かした簡易検出が可能である。
以上の事から、本法は遺伝子検査において有用な増幅法であると考えられる。

第7回日本遺伝子診療学会大会 (2000.6.15; 浜松) 

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