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Abstract
第25回 日本分子生物学会年会(2002.12.11;横浜)
LAMP反応中のリアルタイム濁度モニタによるターゲットDNAの定量
北尾 昌崇、森 安義、富田 憲弘、納富 継宣
(栄研化学株式会社)
新規の核酸増幅法であるLoop-mediated isothermal amplification(LAMP)法は400〜800ng/μlという大量のDNAを合成できる特徴をもつ。この特徴を利用したLAMP反応の検出法に、濁度を測定するという方法がある1)。LAMP反応が進行すると、多量のピロリン酸イオンが遊離するため、不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成する。この結果、LAMP反応が進行した場合のみ溶液中に白濁が生じる。この白濁を目視すれば、インターカレータなどの特別な試薬を用いることなく、容易にLAMP増幅の有無が確認できる。

今回、我々はLAMP反応溶液の濁度をリアルタイムで測定することによって、LAMP反応の速度解析を行い、それをもとに初期鋳型DNA量の定量を試みた。これに伴い複数の反応溶液の温度を一定に保持しながら、リアルタイムで濁度を測定できる装置(リアルタイム濁度計)を開発した。この装置を用いた反応解析は、濃度既知のλ−DNA溶液の希釈系列を調製し、さらにリアルタイムPCR法で検証したものを鋳型として反応を行った。その結果、任意に設定した濁度に到達する時間は初期鋳型量に依存することが分かった。また初期鋳型量の対数に対し濁度検出時間をプロットすると直線が得られた。以上のことから、既知量の鋳型を加えLAMP反応を行えば、白濁検出時間から検量線を作成できることになる。この検量線を用いれば、測定したい試料に含まれる標的DNAの定量が行えるといえる。

このことから、LAMP反応のリアルタイム濁度モニタは臨床及び研究分野の様々な応用が期待できる有用な手法であることを報告する。

1)Mori, Y., Nagamine, K., Tomita. N., notomi, T. (2001) Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation. Biochemical and Biophysical Research Communication 289,150-154

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