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Abstract
第26回日本分子生物学会年会(2003.12.10-13;神戸)
LAMP法を応用した迅速・精確なSNP検出方法の開発
米川 俊広, 葛原 陽子, 神田 秀俊, 納富 継宣
(栄研化学株式会社)
テーラーメイド医療あるいは遺伝子変異による疾病の早期診断のために、既知のmutation(SNPs)を簡易・迅速・精確に検出する方法の開発は非常に重要である。これまでに多くの方法が試されてきたが、スタンダードとなるような簡易・迅速・精確な検出方法は開発されていない。TDI(Template directed Dye-terminator Incorpolation)アッセイ1は、蛍光標識したジデオキシヌクレオチド3リン酸(ddNTP)を基質とする1塩基伸長反応で、取り込まれた塩基の違いをFRETや蛍光偏光などの方法で検出するシンプルで精確なタイピング方法である。PCR法をベースとする既存の方法では、遺伝子増幅と1塩基伸長反応で温度サイクルが必要となるが、これらの反応時間(約3時間)のために迅速性が失われている。そこで、我々は、独自に開発した遺伝子増幅法であるLAMP(Loop mediated isothermal Amplification)法2とTDIアッセイを組み合わせて簡易・迅速・精確なmutation(SNPs)検出方法の開発を試みた。

ヒトのアルコールデヒドロゲナーゼ(ALDH2)遺伝子のエキソン12に存在するSNPsの検出をモデル系として、LAMP法を応用したTDIアッセイを検討した。はじめに、LAMP法でALDH2遺伝子を特異的に増幅し、TDIアッセイの鋳型とした。この鋳型を酵素処理し、余剰のプライマー・基質を不活化した。つぎに、SNPsの1塩基上流までの配列に相補的なプライマーをハイブリダイズさせ1塩基伸長反応を行ない、取り込まれたダイターミネーターの種類によりSNP部位の塩基を判定した。

その結果、既存のPCR法をべ一スにしたTDIアッセイと比較して、遺伝子増幅にLAMP法を用いた本法は以下の点で優れていた。
 1)遺伝子増幅時間。2時間→30分に短縮。
 2)TDIアッセイ反応時間。1時間→5分に短縮。
 3)遺伝子増幅・TDIアッセイの反応温度。→すべて等温反応。
また、タイピングの精確性は通常のTDIアッセイと同等であった。

以上の結果より、LAMP-TDIアッセイは簡易・迅速・精確なジェノタイピング方法であることが確認された。

1;X. Chen et al.(1997):Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761
2;Tsugunori Notomi et al.(2000):Nucleic. Acids Res., 28, e63

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