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Abstract
第26回日本分子生物学会年会(2003.12.10-13;神戸)
LAMP法を用いたリアルタイム濁度検出による血漿中のHBVの定量
幸 保孝, 北尾 昌崇, 森 安義, 納富 継宣
(栄研化学株式会社)
新規核酸増幅法であるLoop-mediated isothermal amplification (LAMP)法は、反応副産物であるピロリン酸マグネシウムを検出することで、核酸増幅の有無を識別することが可能である。また、前回の本学会年会において、この濁度をリアルタイム測定することで、初期鋳型核酸量の定量法が可能であることを示した。そこで今回は、実際に本法が検体の定量に適応可能であるかを確認するために、血漿中のB型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus : HBV)の定量を行ったので報告する。

まず、HBVのres領域600bp をクローニングし、このプラスミドDNAを用いて希釈段階系列を作成した。この系列をそれぞれ鋳型としてLAMP反応を行い、濁度吸光値が0.1に達する時間Tt(分)と初期鋳型核酸量との相関式をHBV定量のための検量線とした。

検量線の作成では、通常のLAMP反応と3'exonuclease活性を有するVent DNA polymeraseを追加した3'exoLAMP法を用いた。その結果、通常のLAMPでは、102〜105copiesの範囲でTt =-3.1747Ln (HBV copy number) + 77.16 (R2=0.9823) であった。 一方、3'exoLAMP では、10〜105copiesの範囲でTt =-2.2289Ln (HBV copy number) + 60.048 (R2=0.9952) であり、通常のLAMPに比べて、高い直線性と広いダイナミックレンジを有する検量線を得ることができた。

HBV血漿からのDNA抽出は、核酸抽出キットEXTRAGEN IIのプロトコルを参照して行った。既知量のHBVを含む血漿を用いて、本法におけるHBVゲノムDNAの抽出効率を求めた結果、約125%と高い値を示した。また、プラスミドDNAで作成した検量線上に、既知量のゲノムDNA検体から得られたTt値がプロットされたことから、作成した検量線が血漿中のHBVの定量に使用可能であることが明らかとなった。

最後に、血漿サンプル中のHBVを3'exoLAMP法および、インターカレーターを用いたreal time PCR法で測定したところ、ほぼ同等の定量値が得られた。また、両法の最低定量感度は共に10copiesであったため、本法はReal time PCR法と同等のHBV定量性能を有するといえる。以上の結果から、本法による血漿中のHBV検体の定量が可能であることが明らかとなった。また、パネル血清中のHBV定量結果についても報告する。
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