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Abstract
第26回日本分子生物学会年会(2003.12.10-13;神戸)
ユビキタス遺伝子検査法の実現に向けた簡易検出法(2) 金属指示薬を用いたLAMP増幅結果の簡易目視検出
富田 憲弘、森 安義、納富 継宣
(栄研化学株式会社)
誰もがどこでもできる遺伝子検査システム(ユビキタス遺伝子検査法)を確立するためには、いかに簡単にわかりやすく増幅結果を提示するかが重要な課題となってくる。そこで今回我々はLAMP反応における反応溶液中の金属イオン濃度の変化に注目する事により、目視で容易に増幅反応を検出する方法を確立したので報告する。

遺伝子増幅法であるLoop-mediated isothermal amplification (LAMP)法1)は、極めて多量(400μg/ml)のDNAが合成され、副産物であるピロリン酸イオンも多量に生成するという特徴がある。ピロリン酸イオンは各種金属イオンと強く結合し不溶性塩を形成するため、LAMP反応が進行するとピロリン酸マグネシウムの白色沈殿を生じ、反応溶液中のマグネシウムイオンの濃度が著しく減少することが知られている2)。LAMP反応溶液中に、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する試薬(金属指示薬)を添加しておくと増幅反応の進行に伴い反応溶液の色が青→赤紫、青→無色と大きく変化した。この結果は、金属指示薬を使用し反応前後のマグネシウムイオン濃度差を観察することでLAMP反応が検出できたことを意味する。さらに他の金属指示薬を用いた検出を可能とするため、マグネシウムイオンと同様にピロリン酸イオンと不溶性塩を形成するマンガンイオンを添加し、蛍光金属指示薬であるカルセインと組み合わせて増幅反応を行った。その結果、増幅反応に伴い非常に明瞭な蛍光を観察することができた。またこの蛍光はリアルタイムでの検出も可能であった。

本方法はシグナルとしての認識性が非常に高いため特別な装置を必要とすることなく目視判定が可能であり、従来の蛍光インターカレーターに比して毒性もなく取り扱いも容易である。よって本検出法は医学・薬学の基礎研究分野、食品分野、環境衛生分野やPOC(現場検査)などにおいてLAMP 法を活用する上で非常に有用であると考えられる。

1) T.Notomi et al., Nucleic Acids Res., 28, e63 (2000)
2) Y.Mori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 289, 150 (2001)

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