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Abstract
第26回日本分子生物学会年会(2003.12.10-13;神戸)
単一蛍光標識プローブを用いた迅速かつ特異的な核酸検出法
葛原陽子、米川俊広、神田秀俊、納富継宣
(栄研化学株式会社)
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 法は「迅速・精確・安価」な核酸増幅法である。本法においても複数の遺伝子を同時に増幅するというマルチプレックス化が可能であることは既に確認し、昨年の年会で発表した。マルチプレックスLAMP を行う場合、個々の遺伝子の増幅を特異的に検出する方法が必要となることから、LAMP 法の迅速性を損なわないような特異的検出法の確立を目的とし検討を進めてきた。

いくつかの検出法を検討した結果、TAMRAで標識したプライマーを反応に用いると、標的遺伝子の増幅に伴って蛍光値が増大するという現象が見出された。プライマー配列を比較してみたところ、蛍光値の増大が見られるプライマー配列にはある規則性があった。その法則に従って、いくつかの増幅系でTAMRA 標識プライマーを設計し反応に用いた結果、全てにおいて増幅に伴う蛍光値の増大が見られた。また、プライマーとして機能しない3' 末端をリン酸化したオリゴDNAを用いても同様の結果が得られた。このことは、蛍光標識オリゴDNAが標的分子にハイブリダイズするだけで、蛍光値の増大が起こることを示している。

さらに、TAMRA 以外で同様の現象が起こる蛍光色素をスクリーニングしたところ、数種類の色素がみつかった。その中の1つであるR110とTAMRAを用いて、2種類の遺伝子の同時増幅系で特異的検出を試みた。その結果、TAMRA およびR110の蛍光値は、それぞれの標的が増幅した場合にのみ増大しており、同一チューブ内で増幅した2種類の遺伝子を特異的に検出することが可能であった。このことは、蛍光波長の異なるものを選択することで、マルチプレックスLAMP の検出にも応用可能であることを示している。また、増幅に伴う蛍光値の変化をモニタリングすることでリアルタイムでの検出も可能である。

以上より、本方法は蛍光標識は1つで良く、プローブ設計も容易であり、LAMP 法の迅速性を発揮する特異的検出法であると言える。
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