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Abstract
第27回日本分子生物学会年会 (2004.12.8〜11;神戸)
LAMP法を応用した迅速・精確なSNP検出法の開発 〜 exo-proofreading 活性を用いて 〜
葛原 陽子、米川 俊広、岩崎 匡臣、神田 秀俊、納富 継宣
(栄研化学株式会社)
テーラーメード医療の実現には、簡易・迅速・精確にSNPsを検出する方法が必須であり、これまでに様々な検出法が試みられている。精確なSNP タイピングの方法の一つにDNA polymerase の 3' - 5' exonuclease活性を利用するものがある。プライマーの3'末端が鋳型とマッチしていればそのまま伸長反応が進み、ミスマッチの場合には 3' - 5' exonuclease活性によって3' 末端が取り除かれた後に伸長するため、3' 末端塩基が取り除かれたかどうかを検出することによりSNPを判定できるという原理である。すでに、この活性を利用したSNP タイピングについてはいくつかの報告があるが、いずれもDNA増幅に PCR を用いていることから、増幅だけで一時間以上を要し迅速性を欠く。そこで、我々は独自に開発した遺伝子増幅法であるLAMP (Loop-mediated isothermal Amplification)法とexo-proofreading 活性を組み合わせて、簡易・迅速・精確な SNP 検出法を開発したので報告する。

ヒトのアルデヒドデヒドロゲナーゼ (ALDH2) 遺伝子のエキソン12 に存在する SNPの検出をモデル系として検討を行った。3' 末端塩基を蛍光標識したSNP 検出プライマーを含む反応液でLAMP法による遺伝子増幅とexo-proofreadingを同時に行い、反応後に蛍光偏光を測定した。その結果、鋳型とプライマーがマッチしている場合の増幅産物の蛍光偏光度は、ミスマッチの場合に対して有意に高く、一塩基の違いを検出できることが確認された。さらに、異なる蛍光物質で標識したwild type 検出プライマーとmutant検出プライマーを用い、反応後にそれぞれの測定波長で蛍光偏光を測定することにより1検体につき1チューブでのジェノタイピングが可能であった。
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