栄研化学株式会社
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製品FAQ 

牛胚性判別試薬キット

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測定原理  キット  サンプリングについて  操作法 判定結果  その他
 測定原理について
原理を教えてください。
本キットは、弊社が開発した遺伝子増幅法であるLAMP法により、牛胚細胞中に存在する雄特異的核酸配列を認識するプライマー(male specific primers)と雌雄共通核酸配列を認識するプライマー(common primers)を用いて核酸の増幅反応を行い、その増幅の有無から牛胚細胞の性判別をおこないます。

時間はどれくらいかかりますか?
LAMP反応・検出用に開発された「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」を使い、増幅反応開始から検出・判定までを約40分でおこないます。

PCR法を用いた性判別との違いを教えてください。
「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」を用いることにより、温度可変装置や電気泳動装置を使わずに、より迅速、簡易に性判別をおこなえることです。それにより、ランニングコストの削減ができます。

LAMP法を用いた性判別の特徴を教えてください。
(1)反応開始から判定まで約40分でおこなえます。(2)LAMP法の高い特異性に加え、雄特異的及び雌雄共通プライマーの使用により誤判定を極力排除しました(3)Loopampエンドポイント濁度測定装置1台で増幅・検出・判定が可能です。温度可変装置・電気泳動装置が不要です。増幅反応から判定まで閉鎖系でおこなえます。

判定をどのように行うのですか。
増幅反応終了後、反応チューブを「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」の反応部から検出部に移し、増幅の有無を増幅反応の副産物として生成するピロリン酸マグネシウムの白濁により検出します。検出結果が「+」「−」でプリントアウトされますので、雄特異的核酸配列を認識するプライマーと雌雄共通核酸配列を認識するプライマーの検出結果をもとに判定(性判別)します。
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 キットに関して
 キットの購入に関して  
Web上での販売はしないのですか。
Web上での販売はしておりません。

キットでなく、試薬だけ購入したいのですが。 
キットを構成する各試薬の分割販売はおこなっておりません。

 キット内容について
キット以外に何を用意すれば良いでしょうか?
マイクロマニピュレーションに必要な器具
・Loopamp反応チューブ
・検体前処理用滅菌チューブ    
・マスターミックス調製用滅菌チューブ  
・ピペット(0.5〜10μL、10〜100μL、100〜1,000μL)  
・微量簡易遠心機  
・フィルター付チップ 
・Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100

何検体検査できますか。
1連の検査毎にコントロール(陽性コントロール・陰性コントロール)を置く事をお勧めしています。そのため、コントロール反応分を差し引いた検体数(1アッセイで最大22検体)の性判別が可能です。

1回の測定ごとにコントロールが必要でしょうか?
DNAの増幅反応が正常におこなわれたかを確認する為に、一連の検査毎にコントロールを置く事をお勧めします。

 プライマーについて

プライマーの配列を教えてください。
公開しておりません。

雄特異的反応用プライマーはどの遺伝子配列を認識していますか。
北海道立畜産試験場が発見した雄特異的遺伝子配列をターゲットとしています。詳細は当該施設が出願している特許(特許第2664646号)をご参照ください。

雌雄共通反応用プライマーはどの遺伝子配列を認識していますか。
公開しておりません。

LAMP法にはループプライマーがあると聞いています。キットに添付しているのでしょうか。
ループプライマーはLAMP法において増幅時間を短縮するために使いますが、「Loopamp牛胚性判別試薬キット」でも利用されています(Reaction Mix中に既に添加されています)。

 酵素について
PCR法の酵素とどう違いますか。
LAMP法で使われる酵素はPCR法でよく利用されるDNA合成酵素とは異なり鎖置換型のDNA合成酵素で、DNA合成が伸長していく先に2本鎖があるとそこを剥がしながら合成が進められるタイプの酵素です。

Bst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素が使えないのでしょうか?
キットに添付の酵素をお使いください。LAMP法ではBst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素で使用可能なものもありますが、「Loopamp牛胚性判別試薬キット」はBst Polymeraseを用いて試薬系を最適化しています。

 検出について

増幅の有無の検出を白濁の目視でできますか?
LAMP法ではその高い特異性と増幅効率から白濁により増幅の有無がわかりますが、目視における誤判定を避けるため、「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」により検出・判定を実施してください。

蛍光インターカレーターまたは蛍光目視検出用試薬を加えて蛍光で検出できますか?
弊社では当該試薬系で蛍光検出の十分な検討をしていません。増幅の有無の検出には濁度を「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」で検出してください。
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 サンプリングについて

 バイオプシーサンプルについて

バイオプシーサンプル液は何が使用できますか。
弊社ではマニピュレーション用として一般的に使用されている、PBS、PVA-PBS、PVP-PBS、0.2MSucrose-PBSがLAMP反応に影響を及ぼさないことを確認しています。DNase freeの精製水を用いることも出来ます。

サンプリング量はどれぐらい必要ですか。 
バイオプシーサンプルは、栄養外胚葉の10%以上(10細胞程度)を採取してください。

凍結卵使用で受胎率に影響しますか。
一般的には、新鮮卵に比べて凍結保存卵の受胎率は悪くなると報告されています。

Extraction Solution(EX)添加前のバイオプシーサンプルを凍結保存出来ますか。 
DNA抽出前の凍結保存はサンプル採取の液量が6μLと少量のため、サンプルが不安定になる可能性が考えられおすすめ出来ません。

DNA抽出後のバイオプシーサンプルを凍結保存出来ますか。
抽出操作後に凍結保存(-20℃)した場合1週間程度は安定した反応を示すことを確認しています。

バイオプシーサンプルにExtraction Solution (EX)添加後の放置時間について。
放置時間は5分以上お願いします。放置後3時間までの安定性については確認しています。

バイオプシーサンプルにExtraction Solution (EX)を添加する際、注意することを教えてください。 
バイオプシーサンプル採取後は速やかにExtraction Solution (EX)を添加してください。添加後抽出用のチューブは確実に蓋を閉めて放置してください。蓋を開けたままにすると抽出試薬が劣化し抽出できなくなる可能性があります。

 液の持ち込みについて
バイオプシーサンプルの前処理用滅菌チューブに持ちこむ液量について。 
前処理のための分注量が変更になりました。バイオプシーした牛胚細胞塊を含むバイオプシーサンプル液6μLを用いてください。多い場合はDNAの抽出効率が低下し抽出不可能になります。
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 操作法に関して

 試薬について

試薬の調製法を間違えてしまいました。
使う試薬は微量です。わずかな調製ミスでも大きな誤差となります。その場合はもう一度調製し直してください。

増幅反応まで氷上での操作が必要でしょうか?
酵素の失活を防ぐために、操作中は氷上で実施してください。

有効期間はどれだけ有りますか?
有効期間は製造日から1年間です。

有効期間が過ぎてしまいました。
残念ながら品質の保証はできません。

保存温度は何℃ですか?
貯法は‐20℃です。

室温で放置してしまいました。
影響を否定できませんので新しい試薬をお使いください。

凍結融解は何回まで可能ですか。
10回程度の凍結融解までは、通常問題なく使用できます。

残った試薬の保存法を教えてください。
保存は‐20℃でお願いします。

試薬についての注意点は。 
(1)Extraction Solution (EX)は多めに分注しているためReactionMix(RM)を使い切っても後に残ります。決して別のキットのExtraction Solution (EX)と混ぜて使用しないでください。また、別のチューブに小分けして保存しないでください。
(2)試薬チューブの蓋は分注時以外は必ず閉めてください。特にExtraction Solution (EX)は蓋が開いていたりゆるんでいたりすると、試薬が劣化しDNAを抽出できなくなる可能性があります。
(3)使用途中の試薬や余った試薬を、新しいキットの試薬と混ぜて使わないでください。コンタミネーションや反応不良の原因となります。

 使用機器について
Loopamp エンドポイント濁度測定装置 LA-100」しか使えないのでしょうか。 
テラメックス社製の「Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」をお使いください。それ以外の機器での検討は行っておりません。

反応チューブは「Loopamp反応チューブ」以外でも使えますか。 
「エンドポイント濁度測定装置 LA-100」は必ず専用の「Loopamp反応チューブ」をご使用ください。指定以外のチューブを使用した場合、光透過性の違いにより誤判定を招く可能性があります。

 増幅反応について
増幅反応に入る前の注意点。
試薬の分注ミスがないか反応液量を確認してから、サンプルを添加してください(極端に多かったり少なかったりした場合は分注ミスが考えられます)。サンプルの添加後は、反応溶液に色が付いているかどうか確認してください。色が付いていない場合は、サンプリングミスが考えられます。反応液を混合した後にチューブ壁面に液が付着している場合は、軽く遠心分離機にかけてください。反応チューブの蓋は確実に閉めてください。反応液に気泡が無い様に注意してください。 「 Loopampエンドポイント濁度測定装置LA-100」のホットボンネットを確実に閉めてくだ さい。

 電気泳動の検出について
電気泳動で検出ができますか。
LAMP法は増幅効率が高いため増幅産物が大量に生成されます。そのため、コンタミネーションの原因となる電気泳動は行わないでください。

 測定操作について
雄特異反応のみ測り、雌雄共通反応を測らなくてもいいでしょうか。
万一、サンプル調製ミスで牛胚のDNAが反応チューブに入らなかったとき、あるいは、何らかの原因でサンプルが変性した時などの場合、雄特異反応のみだと誤判定につながります。この種の誤判定を防ぐためにも雌雄共通反応を実施してください。

コントロールは必要ですか。
DNA増幅反応が正常に進んだか確認するために、必ずコントロールを置くようにしてください。

陰性コントロールに水を使えないでしょうか。 
陰性コントロールにはExtraction Solutionと胚の洗浄液(またはバイオプシーサンプル液)を1:1で混合した溶液5μLをサンプル溶液の代わりに添加してください。

コントロールを置くのを忘れてしまいました。
誤判定を避けるために、再試験をおこなってください。

陽性コントロールが(−)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

陰性コントロールが(+)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

反応チューブに傷が入ってしまいました。
反応チューブに傷があると正しく測定できず、場合によっては誤判定の原因となります。反応チューブの取扱いには十分に注意してください。すでに操作を始めた場合は傷のついたチューブのサンプルは再試験をしてください。

試薬の廃棄方法に注意は必要ですか?
有害な物質は入っていません。地域の廃棄方法にしたがって廃棄してください。

反応に使ったチューブの廃棄方法に注意は必要ですか?
反応に使用したチューブの蓋は開けずに廃棄してください。できれば、密閉できるビニール袋や容器に入れて廃棄してください。蓋を開けた場合、反応液の飛沫による実験室の汚染の恐れがあります(飛沫中のDNAによるコンタミネーション)。
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 判定結果に関して

 判定結果について
雄特異反応が(+)、雌雄共通反応が(−)に出ました。
サンプリングミスや、増幅反応が適切に進行していない等の可能性があります。再試験をおこなってください。

雄特異反応、雌雄共通反応共に(−)に出ました。
サンプリングミスや、増幅反応が適切に進行していない等の可能性があります。再試験をおこなってください。
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 その他
発送方法は?
弊社では、製品を安定した品質でご提供するため、「クール宅急便(冷凍タイプ)」にてお届けしております。
お受け取り後は、製品の品質保持のため速やかに冷凍庫保存(-20℃保存)してください。
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