栄研化学株式会社
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製品FAQ 

ジアルジア検出試薬キット

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測定原理  キット  操作法  その他
 測定原理について
原理を教えてください。
本キットは、弊社が開発した遺伝子増幅法であるLAMP法により、ジアルジア属の18S rRNAに特異的な遺伝子配列を認識するプライマーを用いて核酸の増幅反応を行い、反応時に副産物として生成するピロリン酸マグネシウムの白濁を検出することによってジアルジアの検出を行います。

時間はどれくらいかかりますか?
環境水(水道水等)から磁気ビーズ法で濃縮したジアルジアのシストを検体とし、DNA抽出および試薬調製(約60分)後、専用のリアルタイム濁度測定装置を用いることにより、増幅反応開始から検出・判定までを約60分で行うことができます。
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 キットに関して
 キットの性能に関して  
検出対象は?
磁気ビーズ法で濃縮した環境水(水道水等)検体からジアルジアを検出します。
 
特異性は?
Giardia intestinalis以外にもGiardia murisを検出することを確認しており、ジアルジア属に特異的です。
   
検出感度は?
Giardia intestinalisの標的遺伝子領域を挿入したプラスミドDNAを検体として測定した場合の検出感度は60コピー/testです。
   
定量はできますか?
本キットは定性キットであり、定量測定を目的に開発されたものではありません。
   
不活化されたオーシストも検出してしまうのですか?
本キットはジアルジアの遺伝子を検出しますので、不活化されて感染性のないシストも検出する可能性があります。

 キットの購入に関して  
キット内の試薬だけ購入できますか?
キットを構成する各試薬の分割販売はおこなっておりません。

 キット内容について
キット以外に何を用意すれば良いでしょうか?
以下の器具・装置が必要となります。
・マスターミックス調製用滅菌チューブ(0.5mLまたは1.5mL) 
・ピペット(0.5〜10μL、10〜100μL、100〜1,000μL) 
・フィルター付チップ  ・滅菌チューブ(2.0mL) ・Loopamp反応チューブ 
・反応チューブ冷却用アルミ製ラック  
・氷(クラッシュアイス) 
・LAMP法専用リアルタイム濁度測定装置 
・小型冷却遠心機  ・微量簡易遠心機  ・ヒートブロック  ・ボルテックスミキサー
・-80℃フリーザーまたはドライアイス+アセトン ・超音波洗浄機

何検体検査できますか。
1キットは48テスト用ですが、一連の検査毎にコントロール(陽性コントロール・陰性コントロール)を置く事をお勧めしていますので、コントロール反応分を差し引いた検体数の検査が可能です。

 プライマーについて

プライマーの配列を教えてください。
公開しておりません。

LAMP法にはループプライマーがあると聞いています。キットに添付しているのでしょうか。
ループプライマーはLAMP法において増幅時間を短縮するために使いますが、Loopampジアルジア検出試薬キットでも利用されています(Primer Mix.Gia中に既に添加されています)。

 酵素について
DNA合成酵素はPCR法で使用するものとどう違いますか?
Bacillus stearothermophilus 由来のDNA Polymerase Iから5'→3'exonuclease 活性を除いた鎖置換型DNA合成酵素です。PCR法でよく利用される酵素とは異なり鎖置換型のDNA合成酵素で、DNA合成が伸長していく先に2本鎖があるとそこを剥がしながら合成が進められるタイプの酵素です 。

Bst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素は使えますか?
LAMP法ではBst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素で使用可能なものもありますが、Loopampジアルジア検出試薬キットはBst Polymeraseを用いて試薬系を最適化していますので、キットに添付の酵素をお使いください。

 検出について

濁度もしくは蛍光による目視検出は可能ですか?
LAMP法では増幅反応時に産生される副産物の濁りを目視で観察することができますが、誤判定を避けるためにはLAMP法専用のリアルタイム濁度測定装置にて、検出・判定を実施してください。また、蛍光目視検出試薬による蛍光検出については、サンプルに含まれる共存物質の影響を無視できないため、お勧めすることはできません。
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 操作法に関して

 試薬について

コントロールは必要ですか?
核酸増幅反応が適切に進行したか確認するために、必ずコントロールを置くようにしてください。

陰性コントロールに水は使えないでしょうか?
キットに添付のDistilled Waterをご使用ください。

1回の検査ごとにコントロールが必要でしょうか?
DNAの増幅反応が正常におこなわれたかを確認する為に、1連の検査毎にコントロールを置く事をお勧めします。

コントロールを置くのを忘れてしまいました。
誤判定を避けるために、再試験を行ってください。

試薬の調製法を間違えてしまいました。
使う試薬は微量です。わずかな調製ミスでも大きな誤差となります。その場合はもう一度調製し直してください。

増幅反応まで氷上での操作が必要でしょうか?
酵素の失活を防ぐため、マスターミックスの調製、マスターミックスとサンプル及び陰性・陽性コントロールとの混合は、全て氷上で実施してください。

試薬はどのくらい凍結融解できますか?
凍結融解を20回繰り返した結果では、試薬の劣化は認められておりませんが、無用な凍結融解は品質保持のため避けてください。

マスターミックスは調製後どのくらいの時間安定ですか?
氷上で2時間までは安定とのデータはありますが、できるだけ早く使用してください。

有効期間はどれだけ有りますか?
有効期間は製造日から1年間です。

有効期間が過ぎてしまいました。
残念ながら品質の保証はできません。

保存温度は何℃ですか?
‐20℃で保存してください。

室温で放置してしまいました。
影響を否定できませんので新しい試薬をお使いください。

残った試薬の保存法を教えてください。
‐20℃で保存してください。

増幅反応に入る前に何か注意は必要ですか?
反応チューブにキズや亀裂がないことを確かめてください。試薬の分注ミスがないか、反応液量を確認してからサンプルを添加してください(極端に多かったり少なかったりした場合は分注ミスが考えられます)。反応チューブの蓋は確実に閉めてください。反応液を混合した後にチューブ壁面に液が付着している場合は、軽く遠心分離機にかけてください。反応液に気泡がない様に注意してください。リアルタイム濁度測定装置の蓋を確実に閉めてください。

Loopamp濁度測定装置で測定したとき、増幅反応時の曲線はどのような形になるのですか?
取扱説明書にリアルタイム濁度測定装置を用いた場合の増幅曲線パターンを記載しています。通常、反応開始後しばらくは平坦な直線となり、増幅反応時の副産物であるピロリン酸マグネシウムの粒子が生成しはじめると、間もなく傾きの大きな直線的な上昇カーブを描きます。その後カーブは緩やかになり平衡状態を経て粒子の沈降とともに徐々に下降してきます。検体によっては測定時間内に下降しない場合もあります。

 測定、測定結果について
陽性コントロールが(−)に出ました。
各試薬を所定量加えているか、試薬を入れ間違えていないか、マスターミックスおよび反応液の攪拌が十分であったかご確認ください。また、専用以外の反応チューブを用いた場合や専用の反応チューブをUV照射した場合は、誤判定の原因となります。ご確認の上、再試験をおこなってください。

陰性コントロールが(+)に出ました。
コンタミネーションの可能性があります。また、専用以外の反応チューブを用いた場合や専用の反応チューブをUV照射した場合は、誤判定の原因となります。ご確認の上、再試験をおこなってください。

陽性コントロールの立ち上がり時間がバラツクのですが。
マスターミックスおよび反応液の攪拌が十分でなかった可能性があります。ご確認の上、再試験をおこなってください。

陽性コントロールの濁度値がバラツクのですが。
マスターミックスおよび反応液の攪拌は十分でなかった可能性があります。また、専用以外の反応チューブを用いた場合や専用の反応チューブをUV照射した場合は、濁度値がバラツク可能性があります。ご確認の上、再試験をおこなってください。

反応チューブに傷がついてしまいました。
反応チューブに傷があると正しく測定できず、場合によっては誤判定の原因となります。反応チューブの取扱いには十分に注意してください。すでに操作を始めた場合は傷のついたチューブのサンプルは再試験をしてください。

 電気泳動の検出について
電気泳動で検出ができますか。
LAMP法は増幅効率が高く増幅産物が大量に生成されるため、電気泳動はコンタミネーションの原因となります。そのため電気泳動等での増幅産物の取扱いは極力避けてください。

 廃棄方法について
試薬の廃棄方法に注意は必要ですか?
増幅産物によるコンタミネーションは誤判定の原因となるばかりでなく、試験環境そのものを汚染し、汚染を除去しない限り、以後の試験で正しい結果が得られなくなる可能性があります。従って、反応後のチューブはキャップを開けずに、焼却処理または密閉できるビニール袋を二重に施し、廃棄の基準に従って処理してください。増幅産物の飛散防止のため、廃棄の際にオートクレーブ処理は行わないでください。
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 その他
発送方法は?
弊社では、製品を安定した品質でご提供するため、「クール宅急便(冷凍タイプ)」にてお届けしております。
お受け取り後は、製品の品質保持のため速やかに冷凍庫保存(-20℃保存)してください。
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