栄研化学株式会社
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製品FAQ 

ノロウイルスGI/GII検出試薬キット

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測定原理  キット  操作法  その他
 測定原理について
原理を教えてください。
本キットは、弊社が開発した遺伝子増幅法であるLAMP法により、ノロウイルスGenotype I (以下GI)および Genotype II(以下GII)genome RNA 内の保存性の高い領域に設計したプライマーを用いてRT-LAMP反応を行い、反応時に副産物として生産するピロリン酸マグネシウムの白濁を検出することによってノロウイルスGIおよびGIIの検出をおこないます。

RT-LAMP法とは?
RT-LAMP法とは、Reverse Transcription - Loop-mediated Isothermal Amplification 法の略で、RNAを鋳型として逆転写酵素によりcDNAを合成し、このcDNAから通常のLAMP法に基づき鎖置換型DNA酵素による、増幅反応を進行させる方法です。

時間はどれくらいかかりますか?
試験材料液からRNA抽出したサンプル溶液とキットの試薬をチューブ内で混合し、その混合液の入ったチューブを専用のリアルタイム濁度測定装置にセットすれば、逆転写反応から検出・判定までを約1時間でできます。つまり、検体を入手した日に結果判定を行うことができます。
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 キットに関して
 キットの性能に関して  
検出対象は?
試験材料液からRNA抽出したサンプル溶液を対象に、ノロウイルスGIおよびGII由来のRNA配列を検出します。
特異性は?
GIプライマーの検討では、GIのgenotype3種、GII/4、腸炎ウイルス4種および腸内細菌6種を対象としてLAMP反応を行った結果、GIのgenotypeが全て陽性と判定されたのに対し、その他は全て陰性と判定されました。また、GIIプライマーの検討では、GIIのgenotype7種、GI/4、腸炎ウイルス4種および腸内細菌6種を対象としてLAMP反応を行った結果、GIIのgenotypeが全て陽性と判定されたのに対し、その他は全て陰性と判定されました。
検出感度は?
GIはノロウイルスのGI/4型転写RNAを用いた検討で、60 copies/testでした。また、GIIはノロウイルスのGII/4型転写RNAを用いた検討で、200 copies/testでした。但し食品、環境などのウイルス量が少ない検体の場合は、感度不足により検出できない可能性があります。
菌数の定量はできますか?
本キットは定性キットであり、定量測定を目的に開発されたものではありません。

 キットの購入に関して  
キットではなく、試薬だけ購入できますか。
キットを構成する各試薬の分割販売はおこなっておりません。

 キット内容について
キット以外に何を用意すれば良いでしょうか?
・マスターミックス調製用滅菌チューブ(0.5mLまたは1.5mL)
・ピペット(0.5〜10μL、10〜100μL、100〜1,000μL)
・フィルター付チップ
・ヒートブロック(95℃で使用)
・Loopamp反応チューブ
・反応チューブ冷却用アルミ製ラック ・氷(クラッシュアイス)
・LAMP法専用リアルタイム濁度測定装置
・微量簡易遠心機 ・ボルテックスミキサー

1キットで何検体検査できますか。
1連の検査毎にコントロール(陽性コントロール・陰性コントロール)を置く事をお勧めしていますので、コントロール反応分を差し引いた検体数の検査が可能です。

1回の測定ごとにコントロールが必要でしょうか?
DNAの増幅反応が正常におこなわれたかを確認する為に、1連の検査毎にコントロールを置く事をお勧めします。

 プライマーについて

プライマーの配列を教えてください。
公開しておりません。

LAMP法にはループプライマーがあると聞いています。キットに添付しているのでしょうか。
ループプライマーはLAMP法において増幅時間を短縮するために使いますが、ノロウイルスGIおよびGII検出試薬キットでも利用されています(2×Reaction Mix. NV 中に既に添加されています)。

 酵素について
PCR法の酵素とどう違いますか。
LAMP法で使われる酵素はPCR法でよく利用されるDNA合成酵素とは異なり鎖置換型のDNA合成酵素で、DNA合成が伸長していく先に2本鎖があるとそこを剥がしながら合成が進められるタイプの酵素です。

Bst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素が使えないのでしょうか?
キットに添付の酵素をお使いください。LAMP法ではBst Polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素で使用可能なものもありますが、ノロウイルスGIおよびGII検出試薬キットはBst Polymeraseを用いて試薬系を最適化しています。

どのような逆転写酵素を用いているのでしょうか?
Avian Myeloblastosis Virus 由来の酵素です。

 検出について

濁度もしくは蛍光による目視検出は可能ですか?
LAMP法では増幅反応時に産生される副産物の濁りを目視で観察することができますが、誤判定を避けるためにはLAMP法専用のリアルタイム濁度測定装置にて、検出・判定を実施してください。また、蛍光目視検出試薬による蛍光検出については、サンプルに含まれる共存物質の影響を無視できないため、お勧めすることはできません。

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 操作法に関して

 試薬について

試薬の調製法を間違えてしまいました。
使う試薬は微量です。わずかな調製ミスでも大きな誤差となります。その場合はもう一度調製し直してください。

増幅反応まで氷上での操作が必要でしょうか?
酵素の失活を防ぐために、操作中は氷上で実施してください。

有効期間はどれだけ有りますか?
有効期間は製造日から1年間です。

有効期間が過ぎてしまいました。
残念ながら品質の保証はできません。

保存温度は何℃ですか?
貯法は‐20℃です。

室温で放置してしまいました。
影響を否定できませんので新しい試薬をお使いください。

残った試薬の保存法を教えてください。
保存は‐20℃でお願いします。

 増幅反応について
増幅反応に入る前の注意点。
試薬の分注ミスがないか反応液量を確認してから、サンプルを添加してください(極端に多かったり少なかったりした場合は分注ミスが考えられます)。反応液を混合した後にチューブ壁面に液が付着している場合は、軽く遠心分離機にかけてください。反応チューブの蓋は確実に閉めてください。反応液に気泡が無い様に注意してください。反応チューブにキズや亀裂がないことを確かめてください。 リアルタイム濁度測定装置のホットボンネットを確実に閉めてください。

RNA抽出液を得た後、DNase処理した液をサンプル溶液として増幅反応を行っても良いでしょうか?
DNase処理によりMg濃度が上昇し増幅反応への影響が考えられますので、DNase処理した液をサンプル溶液として使用しないでください。

Loopamp濁度測定装置で測定したとき、増幅反応時の曲線はどのような形になるのですか?
取扱説明書にリアルタイム濁度測定装置を用いた場合の増幅曲線パターンを記載しています。通常、反応開始後しばらくは平坦な直線となり、増幅反応時の副産物であるピロリン酸マグネシウムの粒子が生成しはじめると、間もなく傾きの大きな直線的な上昇カーブを描きます。その後カーブは時間とともに緩やかになり平衡状態を経て粒子の沈降とともに徐々に下降してきます。
 Loopampリアルタイム濁度測定装置RT-160Cを用いた場合、陽性コントロールや鋳型量が多い検体の反応で、傾きの大きな直線的な上昇カーブの途中で曲線が波打つ形状が見られることがあります(下図)。これは増幅に伴って生成するピロリン酸マグネシウムの凝集塊の粒子径が反応途中で変化することによると考えられます。このような増幅曲線の場合でも判定には影響ありません。

 
GI
 
GII

 電気泳動の検出について
電気泳動で検出ができますか。
検出は可能ですが、LAMP法は増幅効率が高いため増幅産物が大量に生成されるため、電気泳動はコンタミネーションの原因となり得ます。そのため電気泳動等での増幅産物の取り扱いは極力避けてください。

 測定操作について
マスターミックス調製の際、2×Reaction Mix.NV (RM NV)、Primer Mix.NVG1(G2)(PM NVG1(G2))、Disteilled Water(DW)を混合した後、95℃に加熱することになっていますが、加熱しないといけませんか?
本来の性能が得られないケースがありますので、必ず加熱してください。

マスターミックス調製の際、2×Reaction Mix.NV (RM NV)、Primer Mix.NVG1(G2)(PM NVG1(G2))、Disteilled Water(DW)を混合した後、95℃、5分後、氷冷5分となっていますが、加熱および氷冷は5分も必要でしょうか?
使用するヒートブロックや冷却方法により熱伝導率が異なることが考えられます。加熱、冷却ともに溶液全体に熱が確実に伝わるようにどちらの時間も5分としています。

コントロールは必要ですか?
DNA増幅反応が正常に行われたどうか確認するために、必ずコントロールを置くようにしてください。

コントロールを置くのを忘れてしまいました。
誤判定を避けるために、再試験をおこなってください。

陽性コントロールが(−)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

陰性コントロールが(+)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

反応チューブに傷が入ってしまいました。
反応チューブに傷があると正しく測定できず、場合によっては誤判定の原因となります。反応チューブの取扱いには十分に注意してください。すでに操作を始めた場合は傷のついたチューブのサンプルは再試験をしてください。

試薬の廃棄方法に注意は必要ですか?
有害な物質は入っていません。地域の廃棄方法にしたがって廃棄してください。

反応に使ったチューブの廃棄方法に注意は必要ですか?
反応に使用したチューブは蓋を開けずにUV照射して廃棄するか、焼却処理してください。増幅産物の飛散防止のため、廃棄の際に高圧滅菌処理は行わないでください。蓋を開けた場合、他検体の増幅産物による誤判定の原因となるばかりでなく、試験環境そのものを汚染し、汚染を除去しない限り、以後の試験で正しい結果が得られなくなる可能性があります。
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 その他
発送方法は?
弊社では、製品を安定した品質でご提供するため、「クール宅急便(冷凍タイプ)」にてお届けしております。
お受け取り後は、製品の品質保持のため速やかに冷凍庫保存(-20℃保存)してください。
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