栄研化学株式会社
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RNA増幅試薬キット(RT-LAMP)

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測定原理  キット  Enzyme Mix.  プライマー設計 増幅反応  その他
 試薬キットに関して
 試薬に関する注意
保存温度は何度ですか。
-20℃で保存してください。

有効期間はどれだけありますか。
製造から1年間です。

試薬を室温で放置してしまいました。
影響を否定できませんので新しい試薬をお使いください。

反応開始まで試薬は氷上保存ですか。
試薬へのダメージを避けるため氷上保存してください。

キット以外に必要な物を教えてください。
増幅反応のためには、ターゲットDNAを含むサンプル、そのDNAを増幅するためのプライマーが必要となります。LAMP法のためのプライマー設計方法の詳細については、(株)富士通のWeb Site“Net Laboratory”の「LAMP法プライマー設計支援ソフトウェアPrimer Explorer」紹介ページ(http://genome.e-mp.jp/)をご参照ください。
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 機器について
増幅を確認するための推奨する機器があれば教えてください。
LAMP法専用のリアルタイム濁度測定装置をお使いください。
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 Enzyme Mix.について
Enzyme Mix.の中味について教えてください。
Enzyme Mix.はBst DNA polymeraseとAMV reverse transcriptaseをミックスさせたものです。Bst DNA polymeraseは、鎖置換活性を有しており、鋳型となる2本鎖DNAを変性することなしに、DNA合成が可能です。Bst DNA polymeraseは60〜65℃付近を至適温度とし、70℃以上で失活します。AMV reverse transcriptaseはAvian Myeloblastosis Virus由来の酵素です。
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 プライマー設計について
LAMP法のためのプライマー設計支援ソフトはありますか。
LAMP法による増幅にとって適切なプライマー設計が重要なカギとなりますので、設計にあたってはLAMP法プライマー設計支援ソフトをご利用ください。プライマー設計支援ソフトは(株)富士通のWeb Site“Net Laboratory ”の「LAMP法プライマー設計支援ソフトウェアPrimerExplorer」紹介ページ(http://genome.e-mp.jp/)をご参照ください。

プライマー設計支援ソフトでループプライマーの設計はできますか。
富士通”Net Laboratory”の「LAMP法プライマー設計支援ソフトウェアPrimerExplorer V2、V3」でループプライマーの設計ができます。

プライマー設計支援ソフトに任意の制限酵素サイトを自動で付加することが出来ますか。
今のところ対応しておりません。

プライマー設計支援ソフトを用いてAT richな鋳型に対するプライマーを設計する場合に注意することを教えてください。
デフォルトの状態でプライマーが設計されない場合は、各領域の長さを長めに設定(20〜25mer程度)し、各領域のTm値を低めに設定してください。

プライマー設計支援ソフトを用いてGC richな鋳型に対するプライマーを設計する場合に注意することを教えてください。
デフォルトの状態でプライマーが設計されない場合は、各領域の長さを短めに設定(17〜20mer程度)し、各領域のTm値を高めに設定してください。

細菌やウイルスのような変異が多い微生物を検出する場合のプライマー設計で注意することを教えてください。
コンセンサス領域を選んでください。特に、伸長する際の3'末端付近をコンセンサス領域となるようにします。即ち、F2,B2,F3,B3の3'側、F1c,B1cの5'側です。

F1P(B1P)でF1cとF2(B1cとB2)にリンカーは必要ですか。
リンカーは必ずしも必要ではありません。長くすると反応効率が悪くなることがあります。

インナープライマー(FIP、BIP)とアウタープライマー(F3、B3)間の距離はどれくらい取ればいいですか。
距離を0〜60塩基に設定した場合には、増幅を確認しています。アウタープライマー(F3,B3)は、インナープライマー(FIP,BIP)を起点に合成されたDNA鎖を鋳型DNAから1本鎖として剥がすためのプライマーです、基本的にインナープライマーとアウタープライマー間の距離が離れていなくても問題ありません。

各プライマーの濃度を教えてください。
通常インナープライマー(FIP、BIP):1600nM、アウタープライマー(F3、B3):200nM(Innerプライマーの1/8)、 Loopプライマー:800nMに設定します。FIP(又はBIP)の濃度は、F3(又はB3)の8倍以上、LoopプライマーはFIP及びBIPの量に対して1/4〜等量となるよう個々の測定系で至適化することをお勧めします。

プライマーを調製する際の留意点は?
LAMP法の場合、プライマーの精製度が高いほど反応速度は速くなり、反応自体も安定 します。従って、プライマーの一次スクリーニングを目的とする場合は簡易カラム精製グ レード以上であれば問題ありませんが、プライマーを決定する際および決定後は、少なく ともFIP,BIPについてはHPLC精製グレードのものを推奨します。また、プライマー調製時 は、OD値により含量を確認し、濃度調整されることをお奨めします。
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 増幅反応について
鋳型DNAはどの程度の純度が必要ですか。
OD260/OD280が2程度であれば十分です。

感度はどれぐらいですか。
適切に設計されたプライマーセットを用い、適切な増幅条件であれば通常10コピー程度から増幅可能です。

未知の遺伝子配列を増幅することはできますか。
プライマーを設計する必要がありますので、少なくともそれらの領域の遺伝子配列は既知である必要があります。

Loopamp濁度測定装置で測定したとき、増幅反応時の曲線はどのような形になるのですか?

通常、反応開始後しばらくは平坦な直線となり、増幅反応時の副産物であるピロリン酸マグネシウムの粒子が生成しはじめると、間もなく傾きの大きな直線的な上昇カーブを描きます。その後カーブは時間とともに緩やかになり平衡状態を経て粒子の沈降とともに徐々に下降してきます。
 Loopampリアルタイム濁度測定装置RT-160Cを用いた場合、陽性コントロールや鋳型量が多い検体の反応で、傾きの大きな直線的な上昇カーブの途中にコブ状の形状が見られることがあります(下図)。これは増幅に伴って生成するピロリン酸マグネシウムの凝集塊の粒子径が反応途中で変化することによると考えられます。このような増幅曲線の場合でも判定には影響ありません。

 

増幅反応時間はどれぐらいですか。
標的とするRNAから逆転写したDNAとそれに対するプライマー設計で決まります。至適プライマーが設計できていれば、通常60分以内の反応で増幅が確認できます。

反応温度の正確さはどれぐらい必要ですか。
リアルタイムで定量をする場合は反応温度に厳密さが要求されます。エンドポイントで確認する場合、1〜2℃の差でしたら通常数分間増幅時間を延長すれば問題ありません。

鋳型DNAの長さはどれぐらいまで増幅が可能ですか。
現状では、F2からB2までの長さで500bp程度まで増幅を確認していますが、200〜300bpまでが適当と考えています。

ポジティブコントロールの遺伝子が増幅しません。どうしたら良いでしょうか。
原因として、保存方法、有効期限切れ、操作方法の誤り等が考えられます。それらの点を確認してください。

変性操作は必要ないのですか。
原則として変性操作がなくてもターゲットDNAの増幅は可能です。但し、ターゲットによっては変性操作を加えた方が、反応がより確実になる場合があります。

増幅の正確性(fidelity)について教えてください。
増幅時の塩基配列の正確性は、Taq DNA polymeraseを使用したPCR法と同程度のようです。

正しい増幅産物かどうかPCRのように電気泳動による増幅断片のバンドサイズで確認することは出来ますか。
最低増幅断片長で確認できます。最低増幅断片長はラダーパターンの一番小さいバンドのサイズと一致します。プライマーから連続的にラダーのバンドが存在した場合は非特異的増幅です。また、増幅産物を増幅領域内にある制限酵素部位で切断したときのサイズから特異的増幅か非特異的増幅かは区別できます。
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 その他
発送方法は?
弊社では、製品を安定した品質でご提供するため、「クール宅急便(冷凍タイプ)」にてお届けしております。
お受け取り後は、製品の品質保持のため速やかに冷凍庫保存(-20℃保存)してください。
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