栄研化学株式会社
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製品FAQ 

ベロ毒素(VT)タイピング試薬キット

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測定原理  キット  操作法  その他
 測定原理について
原理を教えてください。
本キットは、弊社が開発した遺伝子増幅法であるLAMP法により、腸管出血性大腸菌が保持するベロ毒素(verotoxin;VT)遺伝子1型(VT1)および2型(VT2)の核酸配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーを用いて核酸の増幅反応を行い、その増幅の有無からVTのタイピングをおこないます。

時間はどれくらいかかりますか?
腸管出血性大腸菌と疑われた菌株の菌希釈液を検体とし、専用のリアルタイム濁度測定装置を用い、増幅反応開始からタイピングまでを約1時間で行います。
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 キットに関して
 キットの性能に関して  
タイピングの対象は?
食品微生物検査で腸管出血性大腸菌と疑われた菌株の菌希釈液中の、ベロ毒素(verotoxin;VT)遺伝子(VT1,VT2)をタイピングします。
特異性は?
腸管出血性大腸菌71株、腸管出血性大腸菌以外の大腸菌78株を対象としてLAMP反応を試みた結果、腸管出血性大腸菌VT1(+)/VT2(-)の25株はVT1検出用のプライマーでのみ陽性と判定され、VT1(-)/VT2(+)の23株はVT2検出用のプライマーでのみ陽性と判定され、VT1(+)/VT2(+)の23株はVT1検出用、VT2検出用の両プライマーで陽性と判定されました。また腸管出血性大腸菌以外のVT1(-)/VT2(-)の78株はVT1、VT2検出用のプライマーとも陰性と判定されました。
検出感度は?
VT1、VT2産生大腸菌の培養希釈菌液を用いて試験を行った結果、何れも最低検出感度は60CFU/testでした。
菌数の定量はできますか?
本キットは定性キットであり、定量測定を目的に開発されたものではありません。
死菌も検出してしまうのですか?
本キットは腸管出血性大腸菌が保持するベロ毒素(verotoxin;VT)遺伝子(VT1,VT2)の核酸配列を検出し、タイピングしますので、培養法でコロニーを形成する能力をもつ腸管出血性大腸菌だけでなく、コロニーを形成する能力をもたない培養不能菌や死菌も検出する可能性があります。
反応が阻害されることはありますか?
レバー類の食品検査の場合は、その成分によってLAMP反応が影響を受けますのでご使用になれません。

 キットの購入に関して
キットではなく、試薬だけ購入できますか。
キットを構成する各試薬の分割販売はおこなっておりません。

 キット内容について
キット以外に何を用意すれば良いでしょうか?
・培地(増菌用) ・検体前処理用滅菌チューブ(0.5mL)
・マスターミックス調製用滅菌チューブ(0.5mL、1.5mL)  
・ピペット(0.5〜10μL、10〜100μL、100〜1,000μL)  
・微量簡易遠心機 ・フィルター付チップ
・LAMP法専用リアルタイム濁度測定装置  
・氷(クラッシュアイス) ・Loopamp反応チューブ ・反応チューブ冷却用アルミ製ラック
・ヒートブロック(95℃で使用)

何検体検査できますか。
1連の検査毎にコントロール(陽性コントロール・陰性コントロール)を置く事をお勧めしていますので、コントロール反応分を差し引いた検体数の検査が可能です。

1回の測定ごとにコントロールが必要でしょうか?
DNAの増幅反応が正常におこなわれたかを確認する為に、1連の検査毎にコントロールを置く事をお勧めします。

 プライマーについて

プライマーの配列を教えてください。
公開しておりません。

LAMP法にはループプライマーがあると聞いています。キットに添付しているのでしょうか。
ループプライマーはLAMP法において増幅時間を短縮するために使いますが、本キットでも利用されています(Reaction Mix. VT1、Reaction Mix. VT2に既に添加されています)。

 酵素について
PCR法の酵素とどう違いますか。
LAMP法で使われる酵素はPCR法でよく利用されるDNA合成酵素とは異なり鎖置換型のDNA合成酵素で、DNA合成が伸長していく先に2本鎖があるとそこを剥がしながら合成が進められるタイプの酵素です。

Bst polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素が使えないのでしょうか?
キットに添付の酵素をお使いください。LAMP法ではBst polymerase以外の鎖置換型DNA合成酵素で使用可能なものもありますが、本キットはBst polymeraseを用いることにより試薬系を最適化しています。

 検出について

濁度もしくは蛍光による目視検出は可能ですか?
LAMP法では増幅反応時に産生される副産物の濁りを目視で観察することができますが、誤判定を避けるためにはLAMP法専用のリアルタイム濁度測定装置にて、検出・判定を実施してください。また、蛍光目視検出試薬による蛍光検出については、サンプルに含まれる共存物質の影響を無視できないため、お勧めすることはできません。
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 操作法に関して

 試薬について

試薬の調製法を間違えてしまいました。
使う試薬は微量です。わずかな調製ミスでも大きな誤差となります。その場合はもう一度調製し直してください。

増幅反応まで氷上での操作が必要でしょうか?
酵素の失活を防ぐために、操作中は氷上で実施してください。

有効期間はどれだけ有りますか?
有効期間は製造日から1年間です。

有効期間が過ぎてしまいました。
残念ながら品質の保証はできません。

保存温度は何℃ですか?
貯法は‐20℃です。

室温で放置してしまいました。
影響を否定できませんので新しい試薬をお使いください。

残った試薬の保存法を教えてください。
保存は‐20℃でお願いします。

 増幅反応について
増幅反応に入る前の注意点。
試薬の分注ミスがないか反応液量を確認してから、サンプルを添加してください(極端に多かったり少なかったりした場合は分注ミスが考えられます)。反応液を混合した後にチューブ壁面に液が付着している場合は、軽く遠心分離機にかけてください。反応チューブの蓋は確実に閉めてください。反応液に気泡が無い様に注意してください。反応チューブにキズや亀裂がないことを確かめてください。リアルタイム濁度測定装置のホットボンネットを確実に閉めてください。

Loopamp濁度測定装置で測定したとき、増幅反応時の曲線はどのような形になるのですか?
取扱説明書にリアルタイム濁度測定装置を用いた場合の増幅曲線パターンを記載しています。通常、反応開始後しばらくは平坦な直線となり、増幅反応時の副産物であるピロリン酸マグネシウムの粒子が生成しはじめると、間もなく傾きの大きな直線的な上昇カーブを描きます。その後カーブは緩やかになり平衡状態を経て粒子の沈降とともに徐々に下降してきます。検体によっては測定時間内に下降しない場合もあります。

 電気泳動の検出について
電気泳動で検出ができますか。
検出は可能ですが、LAMP法は増幅効率が高いため増幅産物が大量に生成されるため、電気泳動はコンタミネーションの原因となり得ます。そのため電気泳動等での増幅産物の取り扱いは極力避けてください。

 測定操作について
コントロールは必要ですか。
DNA増幅反応が正常に進んだか確認するために必ずコントロールを置くようにしてください。

陰性コントロールに水を使えないでしょうか。
Extraction Solution for Foods(EX F)を使用してください。

コントロールを置くのを忘れてしまいました。
誤判定を避けるために、再試験をおこなってください。

陽性コントロールが(−)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

陰性コントロールが(+)に出ました。
増幅反応が適切に進行していない可能性があります、再試験をおこなってください。

反応チューブに傷が入ってしまいました。
反応チューブに傷があると正しく測定できず、場合によっては誤判定の原因となります。反応チューブの取扱いには十分に注意してください。すでに操作を始めた場合は傷のついたチューブのサンプルは再試験をしてください。

試薬の廃棄方法に注意は必要ですか?
有害な物質は入っていません。地域の廃棄方法にしたがって廃棄してください。

反応に使ったチューブの廃棄方法に注意は必要ですか?
反応に使用したチューブは蓋を開けずにUV照射して廃棄するか、焼却処理してください。増幅産物の飛散防止のため、廃棄の際に高圧滅菌処理は行わないでください。蓋を開けた場合、他検体の増幅産物による誤判定の原因となるばかりでなく、試験環境そのものを汚染し、汚染を除去しない限り、以後の試験で正しい結果が得られなくなる可能性があります。
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 その他
発送方法は?
弊社では、製品を安定した品質でご提供するため、「クール宅急便(冷凍タイプ)」にてお届けしております。
お受け取り後は、製品の品質保持のため速やかに冷凍庫保存(-20℃保存)してください。
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