栄研化学株式会社
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LAMP法の原理 

プライマー設計

標的遺伝子に対して、3’末端側からF3c、F2c、F1c という3つの領域を、5’末端側からB1、B2、B3という3つの領域をそれぞれ規定し、この6つの領域を用いて下記の4種類のプライマーを設計します。

FIP F2c領域と相補的な配列であるF2領域を3’末端側に持ち、5’末端側にF1c領域と同じ配列を持つように設計する。
F3 Primer F3c領域と相補的な配列であるF3領域を持つように設計する。
BIP B2c領域と相補的な配列であるB2領域を3’末端側に持ち、5’末端側にB1c領域と同じ配列を持つように設計する。
B3 Primer B3c領域と相補的な配列であるB3領域を持つように設計する。
 プライマー設計のポイント
LAMP法による増幅反応を成功させるためには、最適なプライマー設計が必要不可欠になります。
上記の各領域は、LAMP法プライマー設計支援ソフト等を用い、塩基組成、GC含量、二次構造等に注意して設計します。また、Tm値はNearest Neighbor法で求めます。
以下に、プライマー設計上のポイントを示します。
1.プライマー間距離
F2領域の外側〜B2領域の外側までの距離は120〜180塩基、F2とF3領域間、B2とB3領域間は0〜20塩基程度とする。
ループを形成する部分(F2・5’末端〜F1・5’末端、B2・5’末端〜B1・5’末端)の距離は40〜60塩基程度とする。
標的遺伝子の存在の有無が目的の場合、F1領域〜B1領域間はなくても良い。
2.各プライマー領域のTm値
GC rich、Normalの場合60〜65℃、AT richの場合55〜60℃程度とする。
3.各プライマー領域の末端安定性
F1c/B1cの5’末端およびF2/B2、F3/B3の3’末端からそれぞれ6塩基のdGを-4kcal/mol以下とする。
4.GC含量
GC rich、Normal の場合50〜60%、AT richの場合40〜50%程度とする。
5.二次構造
極端に二次構造をとらないようにするとともに、3’末端がAT richあるいは相補的にならないようにする。
6.その他
増幅領域内でプライマーに利用した配列以外の場所に適当な制限酵素部位があると、増幅産物の確認に利用できる。


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プライマーを設計し増幅を行った際に、陰性検体で増幅される等、非特異反応が認められるとのお問い合わせをいただくことがあります。その原因としては、1)コンタミネーションを起こしている、
2)プライマーダイマー等による増幅が起きている、の可能性が考えられます。 1)の場合には、試薬、器具、機械等をすべて新しくすること等で非特異反応は改善されます。しかし、2)である場合は、プライマーの設計が適切ではなかったことが考えられますので、その場合には、プライマーの再設計を行う必要があります。
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