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SNPsタイピング - ヒトゲノムを用いたタイピング

操作手順 クローンを用いたタイピング ヒトゲノムを用いたタイピング 蛍光によるタイピング
 CYP2C19とそのファミリー遺伝子
CYP2C19とそのファミリー遺伝子
薬物代謝遺伝子CYP2C19を標的遺伝子としたSNPタイピングの場合、左図のように、非常に配列の似ているホモロジーの高いファミリー遺伝子の中からCYP2C19のみを特異的に増幅し、更に、SNPを識別しなければなりません。高い特異性を必要とするこのSNPタイピング例は、2種類のプライマーやプローブによる反応系では非常に難しいといわれていますが、4種類のプライマーで6つの領域を規定するLAMP法では、このような例のSNPタイピングも行うことが可能です。
 ヒトゲノム検体を用いたCYP2C19のSNPタイピング
ヒトゲノム検体を用いたCYP2C19のSNPタイピング

上記のデータは、ヒトゲノム検体を用いて、*2allele(左)及び*3allele(右)のSNPsタイピングを行い、横軸にWild Type(WT)用のプライマーに対する反応の蛍光強度、縦軸にMutant Type(MUT)用のプライマーに対する反応の蛍光強度を取って、その結果をプロットしたものです。
その結果、WT用のプライマーでのみ増幅反応が起こっているWTのホモの検体、MUT用のプライマーでのみ増幅が起こっているMUTのホモの検体、および両方のプライマーで増幅が起こっているヘテロ検体が綺麗に分離しています。
※ 社内ボランティア規定に基づき実施
 PCR-RFLP法との比較
  PCR-RFLP
LAMP *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3
*1/*1 30 0 0 0 0 0
*1/*2 0 25 0 0 0 0
*1/*3 0 0 14 0 0 0
*2/*2 0 0 0 9 0 0
*2/*3 0 0 0 0 6 0
*3/*3 0 0 0 0 0 2
n=86
上記のデータから、CYP2C19のgenotypeを決定した結果は、同じ検体を用いて行ったPCR-RFLP法による結果と完全に一致し、更に、シーケンスの結果とも一致しました。
すなわち、従来法であるPCR-RFLP法で3ステップ約5時間を要するCYP2C19遺伝子のSNPタイピングと同様の結果を、LAMP法を用いることで1ステップ30分以内に得ることができました。

【参考】
Validation of the Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Single Nucleotide Polymorphism Genotyping with Whole Blood
Masaomi Iwasaki, Toshihiro Yonekawa, et al. Genome Letters, Vol.2 (3) 119-126, 2003
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