プライマー/増幅原理

LAMP法のプライマー

標的遺伝子に対して、3’末端側からF3c、F2c、F1c という3つの領域を、5’末端側からB1、B2、B3という3つの領域をそれぞれ規定し、この6つの領域を用いて下記の4種類のプライマーを設計します。

FIP
F2c領域と相補的な配列であるF2領域を3’末端側に持ち、5’末端側にF1c領域と同じ配列を持つように設計する。

F3　Primer
F3c領域と相補的な配列であるF3領域を持つように設計する。

BIP
B2c領域と相補的な配列であるB2領域を3’末端側に持ち、5’末端側にB1c領域と同じ配列を持つように設計する。

B3　Primer
B3c領域と相補的な配列であるB3領域を持つように設計する。

基本原理

増幅起点構造の生成

標的遺伝子（鋳型例：DNA）と全試薬を混合し、65℃でインキュベートすることにより、以下に示す反応過程が進行します。

STEP1
2本鎖DNAは65℃付近では動的平衡状態にあるため、いずれかのプライマーが2本鎖DNAの相補的な部分にアニールし、そこから伸長することで片側の鎖がはがされて1本鎖状態になります。そのため、LAMP法では、PCR法のようにあらかじめ2本鎖DNAを1本鎖に熱変性する過程を必要としません。以下の増幅メカニズムは、1本鎖状態になった鋳型にFIPがアニールするところからの説明となります。

STEP2
鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の3’末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成されます。

STEP3
FIPの外側にF3 Primerがアニールし、その3’末端を起点として、鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長していきます。

STEP4
F3 Primerから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが2本鎖となります。

STEP5
FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3 PrimerからのDNA鎖によって剥がされて1本鎖DNAとなりますが、このDNA鎖は、5’末端側に相補的な領域F1c、F1を持つため、自己アニールを起こしてループを形成します。

STEP6
上記（5）のDNA鎖に対してBIPがアニールし、このBIPの3’末端を起点として相補的なDNAの合成が行われます。この過程でループは剥がされて伸びます。更に、BIPの外側にB3 Primerがアニールし、その3’末端を起点として、鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長していきます。

STEP7
上記（6）の過程により2本鎖DNAができます。

STEP8
また、（6）の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため自己アニールし、ループを形成してダンベル型の構造となります。この（8）は、LAMP法における増幅サイクルの起点構造となるものであり、これまでの過程は、LAMP法における増幅サイクルの起点構造を作るための過程ということになります。

LAMP法の増幅サイクル

STEP9
まず（8）の構造で、3’末端のF1領域を起点として自己を鋳型としたDNA合成が伸長し、この時、5’末端側のループは剥がされて伸びます。更に、3’末端側のループのF2c領域は1本鎖であるためFIPがアニールすることができ、そのF2領域の3’末端を起点として、F1領域から先に合成されているDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長していきます。

STEP10
次に（9）において、FIPから伸長合成されたDNA鎖によって剥がされて1本鎖となったF1領域から伸長したDNA鎖は、その3’末端側に相補的な領域を持つためループを形成します。このループのB1領域の3’末端から、1本鎖となった自己を鋳型としてDNA合成が始まります。そして、そのDNA鎖が2本鎖部分となっているFIPからのDNA鎖を剥がしながら伸長し、（10）の構造となります。

STEP11
上記の過程によって、FIPから合成されたDNA鎖は1本鎖となり、その両端にそれぞれ相補的な領域F1、F1c及びB1c、B1を持っているため自己アニールしてループを形成し、（11）の構造となります。この（11）の構造は、先ほどの（8）の構造と全く相補的な構造となります。

STEP12
（11）の構造では、（8）の場合と同様にB1 領域の3’末端を起点として自己を鋳型としたDNA合成が行われ、さらに1本鎖となっているB2c 領域にBIPがアニールして B1 領域からのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が行われます。それにより、ちょうど（8）、（9）、（11）と同様の過程を経て再び（8）の構造ができます。

STEP13
また、（10）の構造において、1本鎖となっているB2c領域にBIPがアニールし、2本鎖部分を剥がしながらDNA鎖が合成されます。そして、これらの過程の結果、同一鎖上に互いに相補的な配列を繰り返す構造の増幅産物がいろいろなサイズでできてきます。

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